Linha celular MOC2

Linha celular MOC2

Protocolos de cultura de tecidos do laboratório Uppaluri para linhas celulares MOCAtualizado 12.12.16

Materiais necessários (ver protocolo IMDM anexo para os reagentes necessários para fazer IMDM MOC mídia de linha)

Sigma Aldrich: DMSO: D2650-100ml

FisherCientífico:

T150Flascos : 07-200-64

T75 garrafas: 10-126-37

Crioviais : 03-374-059

Filtros 45um: 09-754-21

05% Tripsina: sh30236,01

25% Tripsina: sh30042,01

Linhas Indolentes – MOC1, 22

Linhas agressivas – MOC2

Linhas celulares de descongelamento

1. Adicione 21ml de mídia de linha IMDM MOC a um T150 antes de descongelar (ou 10ml a um T75 se quiser descongelar em aT75)

2. Remova o criovial do nitrogênio líquido, frasco de pulverização com 70% de álcool para limpá-lo.

3. Segure a metade inferior do criovial em 37Cwaterbath (sem deixar a tampa tocar a água, para evitar a contaminação) até que haja um pequeno pedaço de gelo deixado flutuando.

4. pulverize criovial novamente com ETOH e coloque no capô. Pipete 1 ml de mídia para o 1 ml de células e adicione estes 2 ml ao T150 que já contém mídia (para fazer um total de 22 ml para um T150).

5. Tome alguns meios já no frasco T150 e enxague a placa cryovialand isto para garantir que você tem todas as células residuais deixadas no criovial.

Congelamento de linhas celulares:

Trabalhe rapidamente, pois o DMSO é tóxico para as células

Para cada frasco T150 com confluência celular de 70-80%, congele 3-4 frascos.

1. Células de colheita de T150 como visto abaixo

2. Gire para baixo em pellet em tubo cônico de 15ml (1000 RPM x5 min)

3. Despejar o sobrenadante

4. Toque no tubo cônico de 15ml para suspender as células

5. Adicione 1,5 ml de mídia de linha IMDM MOC, reconstitua células em mídia – mantenha no gelo

6. Adicione 1,5 ml de mídia de congelamento gota a gota lentamente enquanto o tubo está no gelo

Para fazer mídia de congelamento – 20% DMSO em mídia de linha IMDM MOC. Ex: Para estoque de 20 ml - adicione 16 ml de mídia de linha IMDM MOC e 4 ml de DMSO. Filtro de seringa usando filtro .45um

7. Aliquot 1ml cada a 3 cryovials

8. Armazenar em -80C por não mais de 2 semanas.

9. Coloque no nitrogênio líquido dentro de 1-2 semanas.

Nota: Se desejado, pode aumentar para 2ml IMDM e 2ml mídia de congelamento para armazenar em 4 frascos. Além disso, é boa ideia contar células e gravar no frasco antes de congelar as células.

Linha celular MOC2

Características da linha celular:

Indolente - MOC1: menos agressivo com base em estudos in vivo. Se passar 1:12 de 80% de confluência T150, leva 2-4 dias para alcançar 80% de confluência. As linhas celulares MOC1 levam mais tempo para sair do frasco quando são colhidas em comparação com linhas celulares mais agressivas.

Agressivo - MOC2: mais agressivo com base em estudos in vivo. Se passar 1:12 de 80% confluente

T150, leva 2-4 dias para atingir 80% de confluência. Linhas celulares agressivas saem do frasco muito mais facilmente em comparação com linhas indolentes.

Colheita e passagem de células de T150, 80% de confluência:

1. Verta a mídia do T150 no frasco de descarga

2. Lave uma vez com 10-20ml PBS. Verta a lavagem com PBS.

3. Adicione 1,5 ml de tripsina de 0,05%, frasco de ponta para garantir que a tripsina cobre toda a área de superfície e, assim, toca todas as células (faça isso rapidamente para que as células não sejam expostas à tripsina por muito tempo), despeje a tripsina, em seguida, reaplique outro 1,5 ml de tripsina de 0,25%.

4. Coloque na incubadora 37C. Incubar por 3-4 minutos para linhas celulares agressivas e pode levar até 10-12 min para indolente, mas verificar após 6-8 min.

5. Toque o lado do frasco contra a palma da mão deliberadamente várias vezes para soltar as células

6. Verifique sob o microscópio para ver se as células estão flutuando livremente na mídia. Se a maioria não estiver, coloque de volta na incubadora 37C por mais 3-5 minutos. Tente não deixar as células ficar em tripsina por muito tempo, pois isso matará as células.

7. Uma vez que todas ou a maioria das células estão flutuando, adicione 10ml de mídia de linha IMDM MOC para neutralizar a reação.

8. Pipeta mídia e células do frasco em um cónico de 15ml para células de pellet. Centrifugar a 1000 RPM x 5 min.

9. Derramar o sobrenadante.

10. Para passar as células em 1:12 - ressuspender as células em outros 12 ml de mídia.

11. Tome 1ml deste e coloque em novo frasco T150 com volume total de 22ml de mídia de linha IMDM MOC (diluição 1:12)

12. Coloque de volta na incubadora 37C para crescer. Deve atingir 80% de confluência em 2-4 dias.

Injecção no flanco de ratos (heterotópico):

Concentração celular necessária:

MOC1, MOC22: (injetar células 1e6 em 0,15 ml) = 6,66e6 células/ml MOC2: (injetar células 1e5 em 0,15 ml) = 6,66e5 células/ml

1. Células de colheita com tripsina de 0,25% como observado acima.

2. Depois de neutralizar tripsina com IMDM MOC mídia de linha, girar para baixo a célula em pellet (1000 RPM x5 min) em 50ml cónico. (Nota: use 50ml cónico para permitir que a agulha do calibre pequeno desenhe as células para

injeção.

3. Lave as células por ressuspender a peleta da célula em 10ml de PBS frio de gelo (certificando-se de remover o máximo de mídia contendo FCS possível), girar para baixo a célula em peleta novamente (1000 RPM x5 min)

4. Lave as células novamente ressuspendendo a peleta celular em 3-6 ml de PBS frio com gelo (o volume é determinado pelo tamanho da peleta, pois você usará este volume para contar células)

5. contagem cellsperml usando hemocitometro ou contador celular automatizado, usando azul tripano para

eliminação de células mortas. Usando o número total de células presentes (células/ml x ml total de PBS), calcular o volume necessário para suspender a peleta celular para alcançar a concentração de 6,66e6 (MOC1, MOC22) ou 6,66e5 células/ml (MOC2).

Por exemplo, para MOC1, a contagem de células é: 2,8e6 células/ml x 5ml (PBS) = 14e6 células totais. Células 14e6 / célula 6,66e6 / ml = 2,1 ml de PBS para suspender a peleta celular.

6. Gire para baixo as células em pellet novamente. Derramar PBS sobrenadante (sem aspiração com pipeta). Resuspender a peleta no volume calculado de PBS frio de gelo necessário para alcançar apropriado

concentração, tendo em mente que haverá ~ 200ul deixado no cónico 50ml após derramar sobrenadante.

7. Transferir 50ml cónico no gelo e injetar 0,15ml (150ul) de células por rato no flanco subcutâneo.

8. Injete ratos por protocolo padrão. Usamos seringa de 1 ml. Desenhamos células usando agulha de calibre 21 de 1,5 polegadas e mudamos a agulha para agulha de calibre 26 de ½ polegadas para injetar.

Protocolo para mídia 1L