Princípio do ELISA

O ELISA é baseado na solidificação de antígenos ou anticorpos e marcadores enzimáticos de antígenos ou anticorpos. Os antígenos ou anticorpos ligados à superfície do veículo de fase sólida ainda mantêm sua atividade imunológica, enquanto os antígenos ou anticorpos marcados por enzimas mantêm sua atividade imunológica e a atividade enzimática. Durante a determinação, a amostra testada (para determinar o anticorpo ou o antígeno nele) reage com o antígeno ou o anticorpo na superfície do veículo de fase sólida. Separe o complexo de anticorpos de antígeno formado no veículo de fase sólida de outras substâncias no líquido por meio de lavagem. Os antígenos ou anticorpos marcados por enzimas adicionados também se ligam ao veículo de fase sólida através da reação. Neste momento, a quantidade de enzimas na fase sólida é proporcional à quantidade de substâncias testadas na amostra. Depois de adicionar o substrato da reação enzimática, o substrato é catalizado por enzimas para se tornar um produto colorido, a quantidade do produto está diretamente relacionada com a quantidade de substâncias testadas na amostra, por isso pode ser analisada qualitativamente ou quantitativamente de acordo com a profundidade da cor. Devido à alta eficiência catalítica da enzima, o resultado da resposta imunológica é amplificado indiretamente, permitindo que o método de medição alcance uma alta sensibilidade.

Tipos de ELISA

O ELISA pode ser usado para determinar antígenos e também para determinar anticorpos. Existem três reagentes necessários neste método de determinação: (1) um antigénio ou anticorpo antimicrobiano solidificado, ou seja, um 'imunosorbente'; (2) Antígenos ou anticorpos marcados por enzimas, denominados "conjugados"; 3) Substratos de reações enzimáticas. Dependendo da origem do reagente e das circunstâncias da amostra e das condições específicas de teste, vários tipos de métodos de teste podem ser projetados. Existem principalmente os seguintes tipos de ELISA para testes clínicos:

1. Antigênio de centrifugação de anticorpos duplos

O método de centrifugação de anticorpos duplos é o método comumente usado para detectar o antígeno zui, as etapas operacionais são as seguintes:

1) Ligar anticorpos específicos ao veículo de fase sólida para formar anticorpos de fase sólida. A lavagem elimina anticorpos não ligados e impurezas.

2) Adicionar amostra de inspeção, reação de isolamento. O antígeno na amostra liga-se a anticorpos de fase sólida para formar um complexo de anticorpos de antígeno de fase sólida. Lavar para remover outras substâncias não ligadas.

3) Adição de anticorpos enzimáticos, reação de isolamento térmico. Os antígenos no complexo imunológico de fase sólida ligam-se a anticorpos enzimáticos. * Lavar anticorpos enzimáticos não ligados. Neste momento, a quantidade de enzimas transportadas no veículo de fase sólida está relacionada com a quantidade de antígeno testado na amostra.

4) Adição de cor. O substrato catalítico enzimático na fase sólida torna-se um produto colorido. Determine a quantidade de antígeno na amostra através da comparação de cores.

Em testes clínicos, este método é aplicado para testar antígenos macromoleculares como várias proteínas, como HBsAg, HBeAg, AFP, hCG, etc. Assim que anticorpos heterossexuais contra antígenos testados são obtidos, este método pode ser usado para embalar veículos em fase sólida e preparar compostos enzimáticos. Se a origem dos anticorpos for anti-soro, os anticorpos embalados e marcados por enzimas são retirados de diferentes espécies de animais. Como a aplicação de anticorpos monoclonais, geralmente são selecionados dois monocampos para diferentes clusters determinantes no antígeno, para embalagem de veículos em fase sólida e preparação de compostos enzimáticos, respectivamente. Este método de centrifugação de dois pontos é altamente específico e pode ser testado em um passo com a amostra testada e os anticorpos marcados por enzimas. Em uma determinação em um passo, quando o teor de antígeno testado na amostra é elevado, o antígeno em excesso se liga a anticorpos de fase sólida e anticorpos enzimáticos, respectivamente, e não forma mais um "complexo de clamp". É semelhante ao fenômeno da corrente posterior do excesso de antígeno na reação de precipitação, quando o valor de absorção da cor após a reação (localizado na corrente de excesso de antígeno) é o mesmo que o valor de absorção de uma determinada concentração de antígeno da curva padrão (localizada na corrente de excesso de anticorpos), como medido de acordo com o método habitual, o resultado será menor do que o conteúdo real, o fenômeno é chamado de efeito gancho, porque a curva padrão se curva em forma de gancho após atingir o pico. Quando o efeito gancho é grave, a reação pode até não mostrar cor e apresentar resultados falsos negativos. Portanto, quando se usa um reagente de fase única para determinar substâncias que podem aumentar anormalmente em amostras (por exemplo, HBsAg no soro, AFP e hCG na urina, etc.), deve-se prestar atenção aos valores altos de zui na faixa mensurável. Preparar tais reagentes com anticorpos monoclonais de alta afinidade pode enfraquecer o efeito gancho. Se houver vários clusters determinantes idênticos em diferentes locais da molécula testada, como o cluster determinante a de HBsAg, o mesmo pacote de monomab para essa determinação também pode ser solidificado e compostos enzimáticos preparados. No entanto, a detecção de HBsAg deve prestar atenção ao problema dos subtipos, HBsAg tem adr, adw, ayr, ayw4 subtipos, embora cada subtipo tenha a mesma reatividade do cluster determinante a, que também é um problema que deve ser observado com o método de centrifugação de monoclone. Outro ponto de atenção para a centrifugação de antígenos bicorpos é a interferência do fator reumatoide (RF). O RF é um auto-anticorpo, principalmente IgM, que se liga ao segmento Fc de várias IgG animais. Se as amostras de soro usadas para a centrifugação de anticorpos duplos contêm R F, ele pode atuar como um componente antígeno, ao mesmo tempo que se liga a anticorpos de fase sólida e anticorpos enzimáticos, mostrando uma resposta falsamente positiva. A utilização de F(ab') ou Fab fragmento como reagente para o composto enzimático elimina interferência RF devido à remoção do segmento Fc. Se os reagentes de ELISA de bianticorpo-centrifugação são afetados pela RF foi listado como um indicador de avaliação para esses reagentes. O método de clamping de anticorpos duplos é aplicável à determinação de antígenos macromoleculares binários ou binários, mas não é aplicável à determinação de antígenos semimoleculares e antígenos monovalentes de pequenas moléculas, porque não podem formar clampings de dois pontos.

2. Anticorpos de centrifugação de antígeno duplo

O padrão de resposta é semelhante ao método de centrifugação de anticorpos duplos. Envolte com antígenos específicos e prepare os compostos enzimáticos para detectar os anticorpos correspondentes. A diferença dos anticorpos metrológicos indiretos é que os anticorpos enzimáticos são substituídos por antígenos enzimáticos. As amostras testadas neste método não precisam ser diluídas e podem ser usadas diretamente para medição, portanto, sua sensibilidade é relativamente maior do que o método indireto. O teste anti-HBs em marcadores de hepatite B é frequentemente usado nesta técnica. A chave deste método é a preparação de antígenos marcados por enzimas, deve ser procurado o método de marcação adequado de acordo com a estrutura do antígeno diferente.

Anticorpos Indiretos

O método indireto é o método comumente usado para detectar anticorpos. Seu princípio é o uso de anticorpos marcados por enzimas (anticorpos anti-imunoglobulina humana) para detectar anticorpos testados ligados a antígenos de fase sólida, por isso chamado de método indireto (ver Figura 2-3). Os passos operacionais são os seguintes:

1) Ligar o antígeno específico ao veículo de fase sólida para formar o antígeno de fase sólida. A lavagem elimina antígenos não ligados e impurezas.

2) Adicionar soro diluído testado, reação de isolamento. Os anticorpos específicos no soro se ligam ao antígeno de fase sólida para formar um complexo de anticorpos de antígeno de fase sólida. Após a lavagem, apenas anticorpos específicos são deixados no veículo de fase sólida e outros componentes do soro são lavados durante o processo de lavagem.

3) Adição de anticorpos enzimáticos. A enzima anti-Ig humana pode ser usada para detectar anticorpos totais, mas, geralmente, a enzima anti-IgG humana é usada para detectar anticorpos IgG. Os anticorpos no complexo imunológico de fase sólida ligam-se aos anticorpos marcados por enzimas, marcando assim indiretamente a enzima. Após a lavagem, a quantidade de enzimas no veículo de fase sólida correlacionou positivamente com a quantidade de anticorpos testados na amostra.

4) Coloração do substrato Este método é usado principalmente para o diagnóstico de doenças infecciosas por meio da detecção de anticorpos de patógenos.

A vantagem do método indireto é que, desde que o pacote transformado é antigénico, o mesmo anticorpo enzimático padronizado pode ser usado para estabelecer métodos de detecção de anticorpos correspondentes. A chave para o sucesso do método indireto está na pureza do antígeno. Embora, às vezes, o uso de embalagens de antígeno grosseiras também possa obter resultados eficazes, devem ser purificados na medida do possível para melhorar a especificidade do ensaio. Deve-se prestar especial atenção à remoção de impurezas que podem reagir com soros humanos saudáveis ​​em geral, como antígenos recombinantes de enzimas engenhadas com E. Coli, que podem reagir com anticorpos anti-E. Coli nas células sanguíneas de pessoas infectadas com E. Coli. Os antígenos também não podem conter substâncias que reagem com a Ig humana enzimática padrão, por exemplo, antígenos de plasma humano ou tecidos humanos, por exemplo, a Ig não é removida, e as reações falsamente positivas também ocorrem no teste. Além disso, se o antígeno contém proteínas não relacionadas, também pode afetar o efeito do pacote por causa da adsorção. Outro fator de interferência no método indireto é a inespecificidade das altas concentrações contidas no soro normal. As IgG específicas testadas no soro do paciente representam apenas uma pequena porção do total de IgG. As IgGs são fortemente adsoríveis, e as IgGs não específicas podem ser adesionadas diretamente ao veículo de fase sólida e, às vezes, à superfície do antígeno envolvido. Assim, em métodos indiretos, o envelope de antígeno é normalmente reenvolto com proteínas não relacionadas (por exemplo, proteína do soro bovino) para fechar (bloquear) o espaço vazio na fase sólida. Além disso, a espécime deve ser diluída (1:40 a 1:200) durante o processo de teste para evitar que a base negativa excessiva afete o julgamento do resultado.

Anticorpos da Lei da Concorrência

Este método pode ser usado para detectar anticorpos específicos quando a interferência no material antígeno não é fácil de remover ou quando é difícil obter antígenos purificados suficientes. Seu princípio é que os anticorpos na amostra e uma certa quantidade de anticorpos marcados por enzimas competem para se ligar ao antígeno de fase sólida. Quanto maior a quantidade de anticorpos na amostra, menos anticorpos enzimáticos ligados à fase sólida, portanto, a resposta positiva é clara do que a resposta negativa. Se o antígeno é de alta pureza, pode ser encapsulado diretamente. Se houver substâncias interferentes no antígeno, a embalagem direta não é fácil de ter sucesso, pode ser adotado o método de embalagem de captura, ou seja, primeiro embalado com o anticorpo correspondente ao antígeno de fase sólida, em seguida, adicione o antígeno para formar o antígeno de fase sólida. A lavagem elimina as impurezas no antígeno e, em seguida, adiciona a amostra e anticorpos marcados por enzimas para uma reação de ligação competitiva. Existem vários padrões de anticorpos competitivos que permitem a ligação de amostras e anticorpos marcados por enzimas com antígenos de fase sólida, e o ELISA anti-HBc é geralmente usado. Outro padrão é a adição de amostras com antígenos para a ligação competitiva em anticorpos de fase sólida, a lavagem e a adição de anticorpos enzimáticos após a reação com o antígeno ligado à fase sólida. O teste anti-HBe é geralmente usado.

5. Teste de antígenos da lei da concorrência

Os antígenos ou semi-antígenos de pequenas moléculas não possuem mais de dois locais que possam ser usados ​​para a centrifugação, portanto, não podem ser determinados com a centrifugação de anticorpos duplos, e o modelo de competição pode ser adotado. Seu princípio é que os antígenos na amostra e uma certa quantidade de antígenos marcados por enzimas competem para se ligar aos anticorpos de fase sólida. Quanto maior o conteúdo de antígeno na amostra, menos antígeno marcador enzimático ligado à fase sólida e mais clara a cor após o zui. Este método é usado para testes ELISA de hormônios de pequenas moléculas e medicamentos.

6. captura pacote testado anticorpos

O teste de anticorpos IgM é usado no diagnóstico precoce de doenças infecciosas. O ELISA indireto é geralmente usado apenas para detectar anticorpos totais ou anticorpos IgG. Se os anticorpos IgM são testados diretamente com o método indireto de envelope de antígeno, uma vez que as concentrações mais altas de anticorpos IgG são geralmente presentes simultaneamente na amostra, este último irá competir para se ligar ao antígeno de fase sólida, de modo que alguns anticorpos IgM não podem se ligar à fase sólida. Portanto, se os anticorpos IgM são testados indiretamente com anticorpos anti-IgM humanos, a amostra deve ser tratada primeiro com proteína A ou anticorpos anti-IgG para remover a interferência de IgG. A detecção de anticorpos IgM em ensaios clínicos é frequentemente feita com a captura de pacotes. Primeiro, um pacote de anticorpos anti-IgM humano é solidificado para capturar a IgM em amostras de soro (incluindo anticorpos IgM específicos contra antígenos e IgM não específicos). Em seguida, é adicionado um antígeno que se liga apenas à IgM específica. Em seguida, marcação enzimática de anticorpos específicos contra o antígeno. Em seguida, com a ação do substrato, a cor é associada à positivização da IgM na amostra. Este método é frequentemente usado para o diagnóstico precoce de infecções virais. Os padrões de detecção de anticorpos contra o vírus da hepatite A (HAV) são mostrados nas Figuras 2-7. O fator reumatoide (RF) também pode interferir com a detecção de anticorpos IgM em pacotes de captura, levando a uma resposta falsamente positiva. Portanto, os métodos indiretos de neutralização de IgG têm sido recentemente favorecidos, e os anticorpos anti-CMV IgGM e anti-toxoplasmic IgM foram testados com sucesso com esses reagentes.

Lei ABS-ELISA

ABS é a sigla para avidina (avidina) e biotina (biotina). A afinina é uma glicoproteína com um peso molecular de 60.000 e cada molécula é composta por quatro subunidades que podem se ligar à biotina. A biotina é um composto molecular pequeno com um peso molecular de 244. Os derivados químicamente fabricados - hidroxiambamidamides - podem formar produtos marcadores de biotina com vários tipos de moléculas de tamanho, como proteínas e açúcares, o método de marcação é bastante fácil. A ligação da biotina à afinidade é muito específica, com uma afinidade muito maior do que a reação de anticorpos antígenos, e ambos são extremamente estáveis ​​após a ligação. Uma vez que uma afinidade pode se ligar a quatro moléculas de biotina, o método ABS e ELISA podem ser divididos em dois tipos: o método LAB e o método ABC. Ambos substituem os anticorpos marcados por enzimas (antígenos) no sistema ELISA original por anticorpos (ou antígenos) marcados por biotina. No LAB, a biotina de fase sólida reage primeiro com a afinidade não marcada e, em seguida, a biotina marcada por enzima para aumentar ainda mais a sensibilidade. No início, a afilina foi extraída do soro de ovos, uma glicoproteína alcalina com forte adsorção a um veículo de poliestireno que pode ser usado em ELISA para aumentar a base. As homofilinas extraídas do mofo em cadeia não têm essa desvantagem e há uma tendência para substituir o primeiro nas aplicações de ELISA. Como o ABS-ELISA usa dois reagentes mais do que o ELISA comum, aumentando as etapas operacionais, o ABS-ELISA é pouco utilizado em ensaios clínicos.