Após a conclusão da separação e cultura de fibrócitos derivados do tecido do câncer esofágico humano, a identificação e análise funcional das células são necessárias para garantir que suas propriedades biológicas atendam aos requisitos experimentais. Aqui estão as principais etapas operacionais seguintes:

1. Observação morfológica celular

Observar regularmente a morfologia celular com o microscópio invertido. Fibrocitos protogênicos são geralmente em forma de nave ou polygonal, crescem nas paredes e a citoplasma se estende bem. Se as células circulares flutuantes ou a acumulação anormal ocorrer, pode ser um sinal de poluição ou de mau estado celular e as condições de cultura devem ser reavaliadas.

2. Identificação por imunofluorescência

- Tinção imunofluorescente por marcadores específicos (como Vimentin, α-SMA). Os fibroblastos devem expressar alta Vimentin, e a taxa de alfa-SMA positiva pode refletir seu grau de ativação. Observe definir o controle homotipo para excluir combinações não específicas.

3. Experimento de validação funcional

Detecção da capacidade de proliferação: avaliar a atividade de proliferação celular usando o método CCK-8 ou EdU para comparar as diferenças entre o câncer e os fibrócitos de origem cancerosa.

Análise de secreção de colágeno: Detectar os níveis de secreção de colágeno tipo I / III por meio de ELISA ou Western Blot para determinar sua capacidade de fibrose.

Experimento de co-cultura: Fibrocitos foram co-culturados com linhas de células de câncer esofágico (por exemplo, KYSE-150) para observar seu efeito na migração invasiva das células cancerosas (por exemplo, experimento Transwell).

Congelação e recuperação

- Selecionar as células em fase de crescimento logaritmico, dividir no tubo de congelamento com líquido congelado contendo 10% DMSO, transferir para o nitrogênio líquido após o arrefecimento programado. O banho de água derrete rapidamente durante a recuperação, remove o líquido congelado por centrifugação, resuspenda em meio de cultura sérica de alta concentração e troce o líquido após 24 horas.

Precauções

- Operação estritamente estéril para evitar a poluição por broncógenos;

- O número de transmissões de células originais não é recomendado para exceder 5 gerações, para evitar a deriva fenotípica;

Os experimentos funcionais devem ser repetidos mais de três vezes para garantir a confiabilidade dos dados.