Em ciências da vida, diagnóstico clínico e biofarmacêutica, a análise quantitativa e qualitativa precisa e eficiente das moléculas alvo é essencial. Entre eles, o ensaio de imunoassorção ligado a enzimas (ELISA), com sua sensibilidade, especificidade e alta capacidade de fluxo, tornou-se a tecnologia padrão ouro indispensável em laboratório. O surgimento do kit ELISA normalizou e simplificou o processo operacional dessa tecnologia complexa, permitindo que pesquisadores e analistas clínicos obtivessem resultados confiáveis.

Principios básicos do ELISA: ligação específica de antígenos e anticorpos

O princípio básico do ELISA é usar uma resposta imunológica altamente específica entre antígeno e anticorpo e amplificar e detectar o sinal através de marcadores enzimáticos. Simplificando, assim como uma chave só pode abrir uma fechadura, um anticorpo geralmente reconhece e liga-se apenas a um antígeno específico.

Dependendo do objetivo e do método de teste, o ELISA tem os seguintes tipos:

ELISA direta

Princípio: O antígeno a ser testado é adsorvido diretamente a um veículo de fase sólida, como uma placa de 96 buracos, em seguida, a especificidade do marcador enzimático é adicionada antes de se ligar a ele. Depois de lavar os anticorpos não ligados, adicionar o substrato enzimático para gerar sinais.

Características: Operação com poucas etapas e velocidade, mas o sinal pode ser fraco e cada objeto a ser testado requer anticorpos específicos marcados por enzimas.

ELISA Indireta

Princípio: O pacote de antígeno é colocado na placa, primeiro adicionando um anti-antigeno não marcado para se ligar ao antígeno e depois adicionando um anti-antigeno marcado por enzima (anticorpo que identifica o anti-antigeno). Finalmente, adicione a cor do substrato.

Características: O efeito de amplificação do sinal mostra zhu (um anti-1 pode combinar vários anti-2), alta sensibilidade e alta versatilidade (anti-1 de origem do mesmo gênero pode ser detectado usando a mesma enzima marcadora anti-2), é um dos métodos mais usados ​​por chang.

3. ELISA

Princípio: Esta é a maneira mais específica e sensível de detectar antígenos proteicos. Primeiro, um pacote de "captura de anticorpos" é marcado por enzimas para capturar o antígeno alvo na amostra. Em seguida, outro "anticorpo de detecção" é adicionado para se ligar a outro epitopo do antígeno, formando uma estrutura de "anticorpo-antígeno-anticorpo". Os anticorpos podem ser detectados por meio de um marcador enzimático (método direto) ou por meio de um marcador enzimático (método indireto).

Características: Alta sensibilidade e alta especificidade para a detecção de baixas concentrações de antígenos em amostras complexas (por exemplo, soro, soro de cultura celular). A grande maioria dos kits de ELISA comercializados usam este formato.

Competição ELISA

Principio: Usado principalmente para detectar antígenos de pequenas moléculas (semi-antígenos). Os antígenos a serem testados na amostra competem com quantidades conhecidas de antígenos enzimáticos ligados a anticorpos de liang limitado. Quanto maior a concentração de antígeno a ser testado na amostra, menor a quantidade de antígeno enzimático ligado ao anticorpo e menor o sinal final produzido.

Características: A intensidade do sinal é inversamente proporcional à concentração do objeto a ser testado e é adequada para a detecção de substâncias de pequenas moléculas (como hormônios, medicamentos).

Detecção de sinal: Qualquer que seja a forma, é necessário adicionar um sustrato enzimático no final. As enzimas mais frequentemente usadas são a peroxidase de raiz moringa (HRP) e a fosfatase alcalina (AP). O substrato reage sob a catálise enzimática para produzir produtos coloridos. A intensidade da cor é proporcional à concentração da molécula alvo na amostra, e o valor de absorção é medido por um calibre enzimático, o que permite desenhar curvas padrão e calcular a concentração precisa da amostra a ser testada.

Amplas aplicações do kit de ELISA

A versatilidade dos kits ELISA torna-os excelentes em várias áreas:

Diagnóstico clínico:

Detecção de doenças infecciosas: Detecção de anticorpos virales (como HIV, hepatite B, hepatite C) ou antígenos.

Monitoramento de níveis hormonais: Determinação de insulina, hormônios tireóides, hormônios sexuais, etc.

Triagem de marcadores tumorais: detecção de AFP (alfafetoproteína), CEA (antígeno embrionário do câncer), PSA (antígeno específico da próstata), etc.

Diagnóstico de autoimunidade: detecção de fatores reumáticos, autoanticorpos, etc.

Pesquisa em Ciências da Vida:

Estudo de citocinas e vias de sinalização: Análise quantitativa dos níveis de expressão de citocinas como IL-6, TNF-α, IFN-γ.

Estudo de expressão e interação de proteínas.

Desenvolvimento de medicamentos e avaliação da eficácia: Detectar a concentração de medicamentos no corpo e seu efeito sobre biomarcadores.

Segurança alimentar e quarentena animal:

Detecção de alérgenos: Detecção de alérgenos como amendoim, glúten e outros em alimentos.

Detecção de toxinas: por exemplo, trigemina.

Teste de resíduos de medicamentos veterinários.

Diagnóstico de doenças de plantas e animais.

Etapas de operação padrão do kit de ELISA (por exemplo, o método de clamping)

Kits de ELISA comercializados fornecem todos os reagentes necessários e protocolos otimizados, geralmente incluindo as seguintes etapas-chave:

Preparação antes do experimento:

Retire a caixa do refrigerador e retorne todos os reagentes à temperatura ambiente (cerca de 30 minutos).

Prepare-se para amostras, padrões e controles de qualidade.

Prepare o líquido de lavagem necessário, o líquido de trabalho de anticorpos de detecção, etc.

Processo operacional:

1. O pacote está fechado: (alguns kits já estão pré-embalados, você pode pular esta etapa)

Embalagem: Adicione anticorpos de captura ao orificio da placa de marcação enzimática, crie-os sob condições apropriadas para que os anticorpos sejam adsorvidos na parede do orificio.

Lavagem: Elimine o líquido, limpe a placa do orifício várias vezes com um líquido de lavagem para remover os anticorpos não ligados.

Fechamento: Adicione líquido fechado (por exemplo, BSA, leite degrassado) para preencher os buracos não ocupados por anticorpos, evitando a adsorção não específica nas etapas posteriores e reduzindo o fundo.

2. Amostragem e temperação:

Adicione uma série de padrões, amostras a serem testadas e controles de qualidade com concentrações conhecidas ao orifício.

A placa selada do orifício é mantida a temperatura especificada por um certo tempo, permitindo que o antígeno alvo seja capturado pelos anticorpos capturados.

3. lavagem:

Elimine o líquido dentro do buraco, encha os buracos com líquido de lavagem, deixe-o descansar por um momento e repita 3-5 vezes. Esta etapa é crucial para a remoção completa das substâncias não ligadas e é a chave para obter um baixo nível de fundo e uma alta relação sinal-ruído.

Adicionar anticorpos de teste:

Adicione anticorpos de detecção marcados por enzimas a cada buraco. O anticorpo liga-se a outro epitopo do antígeno alvo capturado para formar uma estrutura de clamp.

Temperature novamente e, em seguida, lave para remover os anticorpos de detecção não ligados.

5. Adicionar a solução de substância:

Adicione uma solução de substrato enzimático fresco (como TMB) a cada poço. Criando-se na escuridão, as enzimas catalisam a reação do substrato para produzir um produto azul (para TMB).

Terminar Reações e Leituras:

Adicione um líquido terminante (como ácido sulfúrico), a reação para imediatamente e a cor da solução passa de azul a amarelo.

Durante um curto período de tempo após a cessação da reação (geralmente dentro de 30 minutos), a absorção (OD) de cada orifício é medida usando um calibrador enzimático a comprimentos de onda específicos (por exemplo, TMB de 450 nm).

Análise de dados:

Leve a concentração do produto padrão como coordenada horizontal, o valor OD correspondente como coordenada longitudinal, desenhe a curva padrão.

Substituindo o valor de OD da amostra a ser testada pela curva padrão, a concentração precisa do antígeno alvo na amostra pode ser calculada.

Por que escolher o nosso kit ELISA?

Alta sensibilidade e ampla gama dinâmica: Detecta concentrações de até pg/mL e abrange uma ampla gama linear.

Especificação de Zhou Yue: Anticorpos de alta qualidade rigorosamente verificados que garantem uma resposta cruzada extremamente baixa.

Excelente repetibilidade: pequenas diferenças dentro e entre lotes garantem resultados estáveis e confiáveis.

Fácil e rápido de operar: placas pré-embaladas, reagentes prontos para uso e instruções detalhadas reduzem significativamente o tempo de experimento.

Linha completa de produtos: abrange vários gêneros e alvos múltiplos para atender às suas diversas necessidades de pesquisa.

O kit de ELISA, uma ferramenta de teste biológico madura, eficiente e sensível, tornou-se a pedra angular para a quantificação e análise de proteínas em laboratórios modernos. Seja para pesquisas científicas de ponta ou diagnósticos clínicos precisos, ele fornece um suporte de dados confiável. A escolha de um kit ELISA de alta qualidade é o primeiro passo para o sucesso do seu experimento.

Navegue pela nossa empresa para encontrar o kit ELISA adequado ao seu objetivo de pesquisa. Se tiver quaisquer questões técnicas, não hesite em entrar em contato com a nossa equipe de suporte técnico.