Para otimizar a eficiência da detecção da PCR convencional, além de otimizar o sistema de reação e o design do precursor, é necessário prestar atenção aos ajustes refinados do processo de amplificação. Aqui estão algumas das principais estratégias:

1. Gradiente PCR para determinar a melhor temperatura de cozimento
A temperatura de cozimento é essencial para a especificidade da amplificação. As temperaturas de cozimento podem ser selecionadas rapidamente por PCR de gradiente, como definir um gradiente de 50°C a 65°C, para evitar falhas de faixa ou amplificação não específicas. Se o valor de Tm do precursor for diferente, tente a "PCR Touchdown", ou seja, reduzir gradualmente a temperatura de cozimento a partir de temperaturas mais altas, aumentando o produto altamente específico em prioridade.

2. Otimização dos parâmetros do ciclo
Tempo de degeneração: para modelos com alto teor de GC, a degeneração inicial pode ser prolongada para 5-10 minutos para garantir que o DNA seja desencadeado.
Tempo de extensão: ajustado de acordo com o comprimento do segmento de amplificação (geralmente calculado em 1kb / min), mas com atenção às diferenças na atividade enzimática. Por exemplo, a alta fidelidade pode levar mais tempo.
Número de ciclos: Ampliação regular recomenda 25-35 ciclos. Excessos de ciclos aumentam o risco de dímeros iniciais e equilibram sensibilidade e especificidade diluindo modelos ou reduzindo o número de ciclos.

3. Uso de Aditivos
DMSO ou betana: alivia os efeitos de estruturas secundárias complexas, especialmente para segmentos longos ou modelos de alto GC (concentrações finais recomendadas de 3-5%).
Otimização da concentração de Mg²+: Mg²+ é um cofatór da enzima Taq, cuja concentração (geralmente 1,5-2,5mM) deve ser equilibrada com os dNTPs. A concentração ideal pode ser determinada por meio de experimentos de gradiente com intervalos de 0,5 mm.

Qualidade e Quantidade do Modelo
Evite usar modelos degradantes ou contendo inibidores. Se a amostra é de DNA ambiental, podem ser adicionadas etapas de pré-tratamento (por exemplo, purificação de coluna). O tamanho do modelo é sugerido entre 1-100ng, o excesso pode levar a uma amplificação não específica e o número de ciclos deve ser aumentado se for muito baixo.

5. Configurações de controle
Inclui controles positivos (modelo conhecido), controles negativos (sem modelo) e controles internos (por exemplo, genes domésticos) para excluir a contaminação do reagente ou anormalidades do sistema.