A otimização dos experimentos ELISA para reduzir o ruído de fundo é fundamental para garantir a precisão dos dados. A seguinte combinação de experiências experimentais oferece recomendações de otimização em aspectos centrais como fechamento, lavagem e seleção de anticorpos:

Otimização de condições fechadas

O fechamento é um passo fundamental para reduzir as ligações não específicas, observando os seguintes pontos:

Escolha de agente de fechamento: 5% de proteína sérica bovina (BSA) ou leite em pó desgorduroso é comumente usado, onde BSA é adequado para a maioria dos casos, especialmente quando a amostra contém altas concentrações de lípidos ou hemolíticos, o uso de BSA deve ser prioritário para evitar interferências. Se a proteína fosforilada for detectada, é necessário evitar o uso de leite em pó desgorduroso contendo caseína.

Tempo de fechamento e temperatura: Normalmente, a temperatura ambiente é fechada por 30 minutos a 2 horas ou 4 ° C durante a noite para melhorar a uniformidade. 37 ° C pode acelerar a reação, mas é necessário ter cuidado para evitar a evaporação.

Formulação de líquido fechado: precisa ser usada para evitar falhas causadas por congelamento repetido.

Otimização das etapas de lavagem

A lavagem adequada é a chave para reduzir o fundo:

Escolha o líquido de lavagem: recomenda-se o uso de tampão PBS com 0,05% de Twain-20 para remover as substâncias não ligadas.

Quantidade e tempo de lavagem: recomenda-se lavar 3-5 vezes por 2-3 minutos cada vez para garantir a remoção dos resíduos de reagentes.

Otimização de anticorpos e reagentes

Massa de anticorpos: selecionar um e outro anticorpos altamente específicos e otimizar os múltiplos de diluição e o tempo de incubação para evitar reações cruzadas.

Controle de imagem: ajustar racionalmente a concentração e o tempo do reagente de imagem para evitar que a imagem excessiva leve ao aumento do fundo.

Outras atenções

Carga de proteína: Certifique-se de que a qualidade da proteína carregada é adequada para evitar que a sobrecarga leve a ligações não específicas.

Ambiente experimental: Evite intensa luz direta, especialmente na fase de coloração e detecção.